RNAseq 教程 (2.3) - 生信学习 | Zhou Xiaozhao = 小钊の笔记 = 前天是小兔子，昨天是小鹿，今天是你

# 目录

1.Module 1 - Introduction to RNA sequencing

2.Module 2 - RNA-seq Alignment and Visualization

3.Module 3 - Expression and Differential Expression

4.Module 4 - Isoform Discovery and Alternative Expression

5.Module 5 - De novo transcript reconstruction

De novo RNA-Seq Assembly and Analysis Using Trinity

6.Module 6 - Functional Annotation of Transcripts

Functional Annotation of Assembled Transcripts Using Trinotate

# 2.3 IGV

# 1.introduction

# Description of the lab

高通量测序最受欢迎的工具 -IGV(Integrative Genomics Viewer)

伴随本教程的文件

IGV Lecture - Brief
IGV Lecture - Long, from Broad Institute

完成本次教程可实现以下工作

可视化各种基因组数据
快速导航基因组
可视化 reads 比对情况
肉眼验证 SNP/SNV

# Requirements

Integrative Genomics Viewer
Ability to run Java
Note that while most tutorials in this course are performed on the cloud, IGV will always be run on your local machine

# Compatibility

本教程是为 IGV v2.3 准备的，可以在 IGV 下载页面上找到。强烈建议使用这个版本。

# Data Set for IGV

使用公开的来自 HCC1143 细胞系的 Illumina 序列数据。HCC1143 细胞系是从一名患有乳腺癌的 52 岁白人妇女体内产生的。这个细胞系的附加信息可以在这里找到:HCC1143 (tumor, TNM stage IIA, grade 3, primary ductal carcinoma) 以及 HCC1143/BL(matched normal EBV transformed lymphoblast cell line).

从细胞系 HCC1143 产生的 reads 比对到这个区域
Chromosome 21: 19,000,000-20,000,000
HCC1143.normal.21.19M-20M.bam
HCC1143.normal.21.19M-20M.bam.bai

# 2. Getting familiar with IGV

# Get familiar with the interface

载入一个基因组:

默认情况下，IGV 加载 Human hg19。如果你研究的是另一个版本的人类基因组，或者另一种物种，你可以通过点击左上角的下拉菜单来改变基因组。在这个教程中，我们将使用人类 hg19。

也可以采用以下方式 ( File -> Load from Server... ):

Ensembl genes (or your favourite source of gene annotations)
GC Percentage
dbSNP 1.3.1 or 1.3.7

Navigation：

在这个参考基因组中可以看到染色体列表，选择 1 号染色体。

location 字段 (在界面的左上角) 中输入，导航到 chr1:10 000- 11000，然后单击 Go。这显示了 1 号染色体的窗口宽 1000 个碱基对，从 10000 号位置开始。

IGV 以颜色序列的形式显示基因组中的碱基序列 (例如 A = 绿色，C = 蓝色，等等)。这使得重复序列，比如在这个区域开始处发现的那些序列，很容易识别。放大一点使用 + 按钮看到参考基因组序列的单个碱基。

你可以在基因组坐标所在的框中输入你感兴趣的基因，然后按 Enter/Return 键。试试你最喜欢的基因，或者 BRCA1。

基因用线和框表示。线代表内含子区域，框代表外显子区域。箭头表示该基因的转录方向 / 链。当一个外显子框变窄，这表示一个 UTR。

# Region Lists

有时，保存当前位置或加载感兴趣的区域真的很有用。为此，IGV 中有一个区域导航器。要访问它，单击 Regions > Region Navigator。在浏览基因组时，可以随时按 Add 按钮保存一些书签。

# Loading Read Alignments

我们将使用乳腺癌细胞系 HCC1143 来可视化比对结果。在速度方面，只有一小部分 chr21 将装载 (19M:20M)。

HCC1143 Alignments to hg19:

HCC1143.normal.21.19M-20M.bam
HCC1143.normal.21.19M-20M.bam.bai

复制文件到你的本地，并在 IGV 中选择 File > Load from File... ，选择 bam 文件，并单击 OK。注意，为了让 IGV 正确地加载它们，bam 文件和索引文件必须在同一个目录中。

# Visualizing read alignments

选择染色体位点： chr21:19,480,041-19,480,386

To start our exploration, right click on the track-name, and select the following options:

Sort alignments by start location
Group alignments by pair orientation

通过右键点击比对界面和切换选项来试验各种设置。想想哪一种方法最适合特定的任务 (例如，质量控制、SNP 调用、CNV 查找)。

# 3.Inspecting SNPs, SNVs, and SVs

# Two neighbouring SNPs

Navigate to region chr21:19,479,237-19,479,814
Note two heterozygous variants, one corresponds to a known dbSNP ( G/T on the right) the other does not ( C/T on the left)
Zoom in and center on the C/T SNV on the left, sort by base (window chr21:19,479,321 is the SNV position)
Sort alignments by base
Color alignments by read strand

# Homopolymer region with indel

Navigate to position chr21:19,518,412-19,518,497

# Coverage by GC

Navigate to position chr21:19,611,925-19,631,555 . Note that the range contains areas where coverage drops to zero in a few places.

**Example **

Use Collapsed view
Use Color alignments by -> insert size and pair orientation
Load GC track
See concordance of coverage with GC content

# Heterozygous SNPs on different alleles

Navigate to region chr21:19,666,833-19,667,007