在上一篇导读中提到，目前在做小立碗藓的单细胞测序，相关的 maker gene 已经能发掘到很多，还缺少转型期相关的 maker gene，看到了 2015 年发表在《The Plant Journal》的文章，使用了激光切割法取特定组织进行转录组分析，区分了 tip-cell（最终发育绿丝体）和 bud-cell（最终发育为配子体），希望能对我寻找转型期相关基因有所帮助。
# Summary
单倍体苔藓配子体具有不同的干细胞类型，包括叶尖细胞分裂成单平面产生丝状原丝体，芽（bud）细胞分裂成三个平面产生轴向配子体芽。这种从丝状生长到三维生长的转变是在苔藓生命周期中逐渐发生的，被认为是从轮藻绿藻祖先进化而来的第一批陆生植物。形态复杂的植物体计划的创新促进了垂直景观的定殖，使复杂的营养和生殖植物形态得以发展。尽管它有着深刻的进化意义，但参与从原丝体组织向三平面分生组织转变的分子程序却鲜为人知。在这项研究中，利用单细胞型转录组学鉴定了 4000 多个差异表达的基因，这些差异表达基因区分了单面原丝体顶端细胞和多平面配子体芽细胞。虽然叶尖细胞和芽细胞的转录体都显示增殖细胞的分子特征，但是芽细胞转录组表现出更广泛的基因种类，转录丰度显著增加。我们的数据表明，在苔藓植物中，与芽模式和不对称细胞分裂有关的基因的联合表达伴随着从平面到三维分生组织生长的转变。
# introduction
陆地植物（胚胎植物）形态复杂的体形图的发育需要分生组织细胞在三维平面分裂。与胚胎植物不同的是，陆生植物轮藻绿藻近亲的分枝丝状生长完全是通过二维的细胞分裂进行的，其中丝状分枝是由斜向扩展的藻丝平面的细胞分裂开始的。最有可能的是，向三维分裂分生组织细胞的转变，能够产生形态上复杂的胚胎植物体形，发生在胚胎植物的一个未知的水生祖先身上。
在苔藓发育的单倍体配子体阶段，这一关键的进化创新从丝状体到直立形态被复现。与维管植物不同，无核无维管苔藓的萌发孢子进行单平面分裂，形成由叶绿体丰富的细胞组成的丝状原丝体，称为绿线体。当原丝体顶端细胞通过单平面分裂延伸纤维时，双平面细胞分裂发生在离尖端更远的地方，从而产生分枝状的原丝体。当暴露于诱导的环境刺激和 / 或生长素的存在下，绿丝状体可能会单面分裂，并转变为第二种丝状细胞类型，称为芽，其中含有倾斜的细胞壁和很少的叶绿体，虽然约有 5% 的芽细胞转化为三维分裂的干细胞（SCs），称为配子体芽。芽细胞是分生组织，形成复杂的芽轴，称为配子体，其中包含称为叶状体的光合侧生器官。为了收集足够的芽材料，用萘乙酸和激动素 (kinetin) 处理，使茎基分枝点的芽（诱导芽）比未处理的对照植株多 12 倍。
配子体由一个分生组织细胞发育而来，同时具有不确定性和器官发生的功能。在种子植物中，茎分生组织被分成功能上不同的多细胞区。分生组织中央区分裂不频繁，维持着不确定的干细胞生态位，而外围区分裂迅速，启动侧器官。植物发育中的一个基本问题是藓类单细胞分生组织芽细胞如何发挥 SC 不确定性和器官发生的综合功能，这些功能在维管植物茎分生组织中被赋予不同的多细胞区。
已知调节苔藓 SC 特性的关键遗传因子包括平行的小 RNA 途径、染色质重塑、转录因子、激素信号传导和转运基因以及细胞分裂的调节因子。在已知的 SC 调节因子列表中，显著缺失的是 KNOTTED 1-like (class I KNOX) 基因，它们在被子植物的茎分生组织中起着不可或缺的作用。尽管转录组学证据表明 I 类 KNOX 基因 MKN2 确实在苔藓的分生组织芽细胞中表达，但小立碗藓 KNOX 基因的靶向敲除没有产生配子体表型。
激光显微切割和下一代测序技术的结合使单个细胞的转录组分析成为可能。在这里，我微切单平面原丝体顶端细胞和芽细胞产生了细胞特异性的小立碗藓转录组。的目标有两个：（i）探索被子植物茎分生组织在单细胞顶端和诱导苔藓芽细胞中的遗传程序的程度，（ii）发现在苔藓配子体二维单面和三维平面 SCs 的分子结构。
转录组比较显示，成千上万的基因转录本区分了叶尖细胞和诱导芽细胞。虽然这两种 SC 类型的转录本都在多能干细胞类型中得到了丰富的功能，但是诱导的芽细胞转录组显示出在被子植物中调节芽模式和不对称细胞分裂的同源基因的积累显著增加。从这些数据中，提出了一个通过茎分生功能和不对称细胞分裂相结合的复杂身体计划进化模型。
# RESULTS AND DISCUSSION
# 成千上万的基因转录本区分芽细胞和顶端细胞
配子体的发育经历了从单面分裂形成不分枝细丝，到形成分枝细丝的双面分裂，最后发展到形成配子体复杂体形的三维分裂。由于平面和三维生长模式都来自于单个分生组织细胞，激光显微切割和转录组学分析这两种不同的 SC 类型是直接的。在顶端细胞和芽细胞群体之间发现了 6957 个显著差异表达的基因。其中 4472 个差异表达基因表现出双重差异表达：1043 个在单平面叶尖细胞中上调，3429 个在三维生长诱导的芽细胞中上调。数据表明，与顶端细胞相比，芽细胞处于转录活跃状态。
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原丝体尖端和配子体芽样本的转录组比较揭示了数千个分离这两种 SC 类型的基因。(a) 激光显微分离使尖端细胞和芽细胞特异分离。(b, c) 10 至 2000 万 reads 生成每个样本类型 (b), 和超过 10000 个基因被发现差异表达 (c)。(d) k - means 聚类之间的差异表达基因的 SC 和全植物 (WP) 转录组显示离散独立分组在三种样本类型。(e) WP、芽、尖转录组间差异表达基因的热图。层次聚类形成的主要基因簇以紫色、黄色、蓝色、橙色和绿色块表示。在 heatmap 的左侧显示缩放后的基因表达水平值条，红色和蓝色分别表示上调和下调。
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# GO 富集分类在芽细胞中丰富，而在尖端细胞中不丰富
对尖端细胞和芽细胞中转录物积累的分析表明，与整个植物转录组相比，有数千个上调转录物（1382 个）和下调转录物（2135 个）。real-time PCR 进一步验证了上调诱导芽和叶尖基因的表达模式。GO 富集分析确定在诱导芽和叶尖转录组数据集中显著富集的预测基因功能。芽细胞 GO 预测主要参与分子模式和发育。这些包括转录因子，蛋白激酶，细胞命运决定和形态发生，以及跨膜外排转运。一些与尖端细胞生长相关的 GO 类也富集在芽细胞，如顶端生长和花粉管生长。原丝体被认为是苔藓尖端生长的主要细胞；转录组数据表明，诱导的配子体发育的某些基因也出现在尖端细胞中。
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Real-time quantitative PCR validation of transcripts enriched in bud SCs and tip SCs.
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与芽转录组中发现的大量发育模式相关的 GO 类别不同，在尖端细胞转录组中富集的 GO 类别大多数与光合功能有关。在尖端细胞转录组中发现了大量与光合作用相关的 GO 类别，表明固碳是顶端细胞的主要功能之一。根毛发育过程中 GO 的富集也被发现，这进一步证明了苔藓原丝体和被子植物根毛之间有共同的生长策略。
令人惊讶的是，在尖端细胞中显著富集的 GO 类没有涉及转录调控、激素反应或表观遗传修饰。先前对原丝体细胞重编程的转录组学研究显示，发育基因的缺失与此类似。
# 涉及茎分生组织模式和细胞不对称分裂的基因在芽细胞中上调
为了确定差异表达的候选基因，从组织特异性转录组中提取了具有所述发育功能的被子植物基因同源物。转录本选自八个功能类别：细胞壁生物发生、细胞骨架和不对称细胞分裂、一般发育、光合作用、细胞周期调节、激素信号、茎尖分生组织发育和表观遗传修饰。下图显示了在尖端细胞转录组（75 个基因）和芽细胞转录组（100）中上调的特定基因转录本的比较。然而，数百个功能未知的差异表达基因在芽或尖端细胞转录体中特异性上调。
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尖端细胞转录组包含大量参与细胞壁生物发生和光合作用的基因，而芽细胞转录组的特征是调控激素信号，表观遗传修饰，芽顶端分生组织发育，细胞周期调节，细胞骨架和不对称细胞分裂的基因。
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在诱导芽细胞转录组中，表达上调的基因可以指导芽分生组织模式的形成和不对称的细胞分裂。例如，拟南芥受体信号转导基因的同源物，这些基因调节茎的分生组织大小和模式，包括 CLAVATA 1 和 2（CLV1 和 CLV2）、MERISTEMATIC RECEPTOR-LIKE KINASE（MRLK）、丝裂原活化蛋白激酶激酶 YODA（YDA）、ERECTA-LIKE，CRINKLY4（CR4）和 calpain 编码的信号基因 DEFECTIVE KERNEL1（DEK1）。
在被子植物茎分生组织的中心区和外围区，多种染色质重塑复合物调控着细胞命运的转变。在 bud 细胞中，包括拟南芥 SWI/SNF 复合物同源基因在内的多种染色质重塑基因也上调，但在 tip 细胞中没有上调。先前的研究表明，原丝体和配子体具有不同的染色质状态；这些上调的染色质重塑因子可能参与了染色质状态的改变。此外，显示与染色质重塑复合物相互作用的细胞周期同源物在诱导芽细胞转录组中特别上调，例如直接 SWI/SNF 相互作用因子 E2F 转录因子（E2F），以及一些周期蛋白（CDC/CYC）和细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）。
bud 细胞富含参与控制细胞不对称分裂的特定细胞周期调节因子，包括 CYCB1;1，CDKA1;1 和 E2F 的同源物，对分化组织和复杂植物结构的发育至关重要。一种由不对称细胞分裂引起的预测功能是配子体芽细胞中不均匀的细胞分裂形叶状体前体细胞。与含有 10 多种细胞周期调控因子的诱导芽细胞转录组相比，尖端细胞转录组只有两个显著上调的细胞周期基因（STRUBBELIG 和 CYCLOPHILIN 38） 。
在 bud 细胞中特异性上调的其他 bud 预测的 25 个基因控制植物激素生长素、细胞分裂素和油菜素甾体的生物合成和信号转导的基因。最有趣的是，在 bud 细胞中发现了两个 PIN 基因的同源物。此外，在 bud 细胞中，一种参与 PIN 蛋白极性定位的蛋白激酶 PINOID 的同源物也上调。最近的一项研究表明，在苔藓配子体中，质膜相关的 PIN 蛋白是正常芽发育所必需的。
在被子植物中，大量的转录因子网络参与了对细胞特异性命运和发育模式的控制。值得注意的是，在 tip 细胞中表达上调的转录因子基因不包括模式植物同源的基因。相比之下，bud 细胞中上调的转录物包括与芽图案有关的几种被子植物转录物的同源物，如 DORNROSCHEN-LIKE（DRN-LIKE）和 LEAFY（LFY），表皮 PROTODERMAL FACTOR 2（PDF2）和 SCREAM2（SCRM），以及 I 类 KNOX 基因 MOSSKNOTTED-
RELATED HOMEOBOX 2（MKN2）。bud 细胞中发现 MKN2 上调表达是出乎意料的，因为先前的遗传分析表明，KNOX 基因的功能仅限于孢子体世代。
两种类型的干细胞都是由一个不可区分的单细胞分支点和一个平面细胞分裂产生的。在这一阶段，bud 和 tip 的干细胞在形态上相似，但面临着截然不同的发展命运，这可能是由仅仅两次细胞分裂后数千个差异表达的基因所决定的。在单细胞阶段分离 bud 和 tip 细胞在形态学上是不可行的；然而，这项研究可能有助于识别在 tip 和 bud 细胞命运形态表现之前的分子标记。
# CONCLUSION
被子植物模式植物基因同源物和不对称细胞分裂调控因子的协同上调启发了一个模型，其中这些遗传途径的协同作用有助于在形态复杂的配子体中发现新的发育创新。从这个观点来看，这些组合的发育功能所赋予的特性可以使 bud 细胞出现新的干细胞功能，以及由覆盖侧器官启动程序的不对称分裂程序所赋予的器官发生。分生组织母细胞的不对称分裂产生了包括气孔复合体的多种细胞类型；然而，分生组织母细胞的这种多能性是短暂的。气孔的最早古植物学证据与苔藓植物的出现相吻合。推测苔藓配子体分生组织功能发育途径的出现，可能在气孔演化过程中起到了类似的作用。
